百抗当头！治疗性抗体发现的格局和趋势
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- 发布时间：2021-07-21 17:00
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目前治疗性抗体行业正在飞速的发展，已经有100多种抗体获批上市用于治疗肿瘤，自身免疫疾病，感染性疾病等。
这些抗体中多数初始来源为小鼠，但是随着噬菌体，人源化小鼠和单个B细胞技术的不断完善和成熟，已经有越来越多的体利用这些技术开发的全人源治疗抗体上市造福患者。与嵌合抗体和人源化抗体相比，全人源抗体免疫原性风险更低，因此全人源抗体在将来必然占据主要地位。
百抗当头！治疗性抗体发现的格局和趋势
目前治疗性抗体行业正在飞速的发展，已经有100多种抗体获批上市用于治疗肿瘤，自身免疫疾病，感染性疾病等。
这些抗体中多数初始来源为小鼠，但是随着噬菌体，人源化小鼠和单个B细胞技术的不断完善和成熟，已经有越来越多的体利用这些技术开发的全人源治疗抗体上市造福患者。与嵌合抗体和人源化抗体相比，全人源抗体免疫原性风险更低，因此全人源抗体在将来必然占据主要地位。
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以下文章来源于抗体密码 ，作者大脸猫
抗体发现的主要途径
从1986年第一个治疗性抗体Muromonab-CD3被批准上市以来，到目前为止已经有100多个抗体批准上市，从抗体的属性角度来看，这些抗体共分为四大类，鼠抗体，嵌合抗体，人源化抗体和人抗体。
随着噬菌体展示，人源化小鼠和单个B细胞技术的发展，目前越来越多的全人源抗体的获批上市，截至目前已经有36款全人源抗体获批上市，包括最近获批的Amivantamab（EGFR/cMET）双抗和Aducanumab(Amyloidbeta)等。
已上市的全人源抗体
杂交瘤
1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术，该技术于1984年获得了诺贝尔医学和生理学奖。
目前已经批准上市的治疗性抗体中，多数来自于杂交瘤小鼠，这是因为鼠抗的开发比较高效，并且节约成本。但是鼠抗如果不进行人源化改造，进入人体内会产生针对鼠抗的抗体（HAMA），HAMA不仅使抗体被快速清除，而且还有潜在的副反应。目前有两种方法可以对鼠源的单克隆抗体进行人源化改造：嵌合抗体和人源化抗体。
嵌合抗体是通过抗体重组技术，将鼠源抗体的可变区（轻链可变区和重链可变区）与人抗体的恒定区进行组合，嵌合抗体不仅保留了抗体的亲合力和高特异性，而且可以将抗体的鼠源性降低70%，因此可以很大程度的降低抗体在人体内的免疫原性。第一个批准上的嵌合抗体是Abciximab，其靶向GPIIb/IIIa，该抗体为Fab片段，于1994年被FDA批准上市。
人源化抗体最普遍的做法是将鼠抗的CDR区移植到人抗体的框架中，该方法由Gregory P.Winter于1986年开发。与嵌合抗体相比，CDR区移植抗体的人源程度进一步提高。达利珠单抗（daclizuman）是第一个被批准的利用CDR移植方法进行人源化的抗体，该抗体结合的抗原是IL-2，用来抑制移植排斥反应。为了降低抗体在人源化过程中亲合力的降低，达利珠单抗的开发者们在人源化过程中选择了和鼠抗结构最相似的抗体。
人源化并不是简单的进行CDR区的移植，因为在某些情况下，鼠抗中非CDR区的某些氨基酸对抗体结合至关重要，这些位点可能参与了抗体抗原决定簇的形成或者直接参与对抗原的结合。这些关键位点需要在CDR移植后进行恢复突变，突变为原来鼠抗的氨基酸，这样不仅能保证抗体的亲合力，而且可以维持抗体的稳定性。
噬菌体展示获取人源抗体
噬菌体展示技术是目前最流行的的在体外筛选抗体的方法，该技术由GeorgeP.Smith于1985年开发，其最初用M13噬菌体的pIII来融合外源的多肽，并且随后构建了能够展示抗体的载体，并且从千万级别的库中筛选亲合力较高的抗体。
随后三个不同的研究机构独立的构建了scFv和Fab的噬菌体筛选库：英国的分子生物学实验室（MRC Laboratory ofMolecular Biology），德国癌症研究中心（GermanCancer Research Center）和美国的斯克里普斯研究所（ScrippsResearch Institute）。
下图为噬菌体筛选的一般流程，首先需要构建噬菌体库（下图A），首先从人的外周血中获取mRNA，并通过逆转录得到cDNA，之后通过多种引物利用PCR获取人所有的抗体的重链可变区和轻链链可变区；然后将这些可变区通过连接到载体上（不同的形式有不同的连接方法，如果是scFv,需要在VH和VL之间加入柔性的linker）。得到的载体通过电转转入大肠杆菌中并在辅助噬菌体的作用下构建表达抗体的噬菌体库。
构建噬菌体库的抗体基因可以来自于人的外周血也可以来自于免疫后的动物，或者通过随机的CDR序列综合性的构建。对于没有进行免疫的噬菌体库，其可变区的序列主要来自于IgM型抗体。与没有进行过免疫的噬菌体库相比，经过免疫构建的噬菌体库有更高的机率筛选到高亲合力的抗体，因为免疫后的噬菌体库来源的抗体经过体内的亲合力成熟的阶段。但是其缺点是，不同的靶点需要构建不同的噬菌体库，并且要求免疫的抗原必须能够刺激免疫系统的反应。
利用噬菌体库筛选对目标抗原有结合的抗体需要多轮的筛选，并且在大肠杆菌中扩大，该过程也被称为“淘选”（下图C）。反复的筛选能够将高特异性亲和的抗体进行富集，但是因为要经过反复的筛选，因此需要花费几周的时间，但是与杂交瘤相比，该过程还是要快的多。
目前已经上市的的噬菌体筛选的抗体，以及噬菌体专利
第一个由噬菌体展示开发抗体是阿达木单抗（Adalimumab），该抗体是由巴斯夫生物研究公司（BASF Bioresearch Corporation）和剑桥抗体（2006年被阿斯利康以13.2亿美元收购）联合开发的。阿达木单抗不仅是第一个噬菌体展示开发的抗体，也是第一个上市的全人源抗体，它于2002年上市，靶向TNFα，用于治疗炎症疾病，如慢性肠炎，银屑病等。除了阿达木单抗外，剑桥抗体还利用噬菌体展示开发了靶向BLYS的贝利木单抗（belimumab），该抗体于2011年获批上市用于治疗系统性红斑狼疮。
利用噬菌体展示技术开发的已上市抗体
噬菌体库构建的相关专利主要集中在四家公司，Dyax,剑桥抗体（已经被阿斯利康收购），再生元和DyaxCorp，这些专利的20年专利权已经到期。
噬菌体展示技术相关专利
人源化小鼠
与其它抗体发现技术相比，人源化小鼠有很多优点，如不需要进行人源化（主要是和鼠抗相比）；产生针对靶点的抗体的种类更多；在体内经过亲合力成熟和克隆的选择，因此无需亲合力成熟等实验，但是因为其需要将人类的抗体相关基因导入到小鼠中，因此其门槛更高。
Alt等人1985年首次提出利用转基因小鼠产生全人源的抗体；1989年Brüggemann及其合作者首次将包含有两个人重链可变区基因（VH）和不同的D基因，并连接有重链连接区（JH）和μ恒定区大小为25Kb的载体通过微注射转入到小鼠的受精卵中，在转基因的小鼠中，只有4%的B淋巴细胞能够检测到人μ基因的表达。1992年Taylor等人构建能同时表达Vκ-Jκ-Cκ和VH-D-JH-Cμ-Cγ1的转基因小鼠，但是这些小鼠表达的抗体仅有10%为人源抗体。
直到1994年，Longberg等人构建了第一个人Ig转基因小鼠HuMab Mouse，他们是将人IgH和IgK的基因转入到鼠IgH和IgK敲除的小鼠中；人IgH 和 IgΚ的基因组大约1.29Mb和1.39Mb，但是转入小鼠体内的基因小于80Kb,因此抗体、的多样性远小于人。1997年Mendez等人将酵母菌人工染色体（IgΚ ~ 700Kb， IgH~ 1 Mb）转入到小鼠胚胎干细胞中，并与IgH和IgK敲除的小鼠进行杂交得到了XenoMouse全人源化小鼠，该小鼠在体内只表达人的抗体。
HuMab Mouse和XenoMouse全人源小鼠虽然解决了小鼠内部抗体对人抗体的干扰并扩大了抗体的多样性，但是因为缺少鼠的Fc因此抗体在鼠体内表达量较低且Ig亚型的转换效率较低，抗体进化中的高频突变也比较低。为了解决这个问题研究者将人类抗体的Fab区与小鼠的抗体的恒定区相连接，构建了嵌合人源化小鼠，目前基于该方案已经有OmniRat，KyMouse，VelocImmune mouse，H2L2 Mouse和Trianni Mouse（下表）
第一个由人源化小鼠开发的单克隆抗体于2006年获批上市，截至到2020年，已经有多达22款由人源化小鼠产生的单克隆抗体获批上市。
单个B细胞技术筛选抗体
单个B细胞技术筛选抗体技术是指通过微流控，激光捕获显微切割技术或者荧光激活分选等技术直接分选B细胞，然后再利用PCR对B细胞的抗体基因进行扩增的技术。
常规的杂交瘤或者人源化小鼠筛选抗体需要前期的长期免疫，而相比之下，单个B细胞技术因为是直接从人体内分选B细胞，因此无需免疫，并且其多样性较好，保留了抗体重链和轻链的天然配对。
单个B细胞的制备首先是对B细胞的鉴定和分离，来源于外周血，淋巴结等组织的B细胞通过密度梯度离心或者流式细胞仪等方法分离；不同的分离方法有不同的特点，密度梯度离心法得到的是B细胞的混合物，因此特异性较差，而流式细胞仪等通过荧光抗原分离的B细胞是能够特异性的和抗原结合的B细胞，因此特异性更强，效率更高，但是该方法比较复杂。
分离后的B细胞裂解后利用合适的引物通过巢式或半巢式逆转录PCR(Nested or semi-nested RT-PCR)对B细胞的抗体基因进行扩增，该过程要求引物具有通用性、灵敏性、特异性，能避免非特异性扩增又能扩增出完整的抗体基因序列，因此引物的设计质量直接决定了抗体的扩增效率。扩增后的抗体序列需要构建到真核或者原核载体在进行表达后鉴定。
目前利用该技术获批的第一个抗体为Ansuvimab，该抗体于2020年12月22日获批上市，用于治疗成人和儿童的埃博拉病毒（Ebola virus）感染，由Ridgeback Biotherapeutics公司开发。
除了Ansuvimab还有多个从人B细胞分离的单克隆抗体正在临床中，如可以中和HIV病毒的3BNC117,VRC01和PGT121（这些抗体都是从患有HIV的精英患者中分离）；可以中和流感病毒的MHAA4549A（从接种流感疫苗的人中分离）；可以中和RSV病毒的MHAA4549A等。
总结
目前治疗性抗体行业正在飞速的发展，已经有100多种抗体获批上市用于治疗肿瘤，自身免疫疾病，感染性疾病等。
这些抗体中多数初始来源为小鼠，但是随着噬菌体，人源化小鼠和单个B细胞技术的不断完善和成熟，已经有越来越多的体利用这些技术开发的全人源治疗抗体上市造福患者。与嵌合抗体和人源化抗体相比，全人源抗体免疫原性风险更低，因此全人源抗体在将来必然占据主要地位。
参考文献：
1、Hélène Kaplon & Janice M. Reichert.Antibodies to watch in 2021.mAbs 20212、Ruei-Min Lu, Yu-Chyi Hwang, I-Ju Liu et al.Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science 2020
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