mRNA药物与关键技术
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- 作者：凯莱英
- 来源：凯莱英Asymchem
- 发布时间：2021-04-14 15:49
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新冠病毒肆虐全球对人类社会造成了巨大损失，但却加速了mRNA药物的研发，有人将2020年称为“mRNA技术元年”。
近年来，mRNA药物在传染病预防、癌症及罕见病治疗等方面展现出重要应用前景，全球创新制药企业竞相投入相关领域研发。基于在生物工程技术领域的持续深耕与积淀，以凯莱英为代表的CDMO企业积极搭建mRNA药物研发与生产技术平台，助力行业创新发展。
mRNA药物与关键技术
新冠病毒肆虐全球对人类社会造成了巨大损失，但却加速了mRNA药物的研发，有人将2020年称为“mRNA技术元年”。
近年来，mRNA药物在传染病预防、癌症及罕见病治疗等方面展现出重要应用前景，全球创新制药企业竞相投入相关领域研发。基于在生物工程技术领域的持续深耕与积淀，以凯莱英为代表的CDMO企业积极搭建mRNA药物研发与生产技术平台，助力行业创新发展。
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以下文章来源于凯莱英Asymchem ，作者凯莱英
新冠病毒肆虐全球对人类社会造成了巨大损失，但却加速了mRNA药物的研发，有人将2020年称为“mRNA技术元年”。近年来，mRNA药物在传染病预防、癌症及罕见病治疗等方面展现出重要应用前景，全球创新制药企业竞相投入相关领域研发。基于在生物工程技术领域的持续深耕与积淀，以凯莱英为代表的CDMO企业积极搭建mRNA药物研发与生产技术平台，助力行业创新发展。
1. mRNA药物研发进展
mRNA药物概念是由Wolff等人在30年前提出的，当时证明向小鼠骨骼肌直接注射体外转录mRNA（IVT mRNA）或质粒DNA（pDNA）能导致在小鼠肌肉中表达编码蛋白。但由于mRNA不如DNA稳定，此前研究多关注pDNA和病毒DNA技术。20世纪90年代起，科学家开始对mRNA进行初步探索性应用，包括蛋白替代和疫苗接种等方法拟用于癌症治疗和传染病防治。而近年，相关领域迎来了新的研发热潮。
图1. mRNA药物技术的历史发展脉络 （绿色框：mRNA机理研究的里程碑事件；蓝色框：mRNA药物研发的里程碑事件）
来源：mRNA Vaccine Era—Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection, International Journal of Molecular Sciences
mRNA药物具有以下优势：首先，可在有丝分裂和非有丝分裂的细胞中发挥作用，而无需进入细胞核；其次，mRNA编码蛋白的持续周期基本可预测（数天或数周）；与pDNA和病毒载体不同，mRNA不包含其他外源基因，因此作为载体更“纯粹”、更安全；此外，mRNA能通过无细胞技术体外合成，极大降低了被其他成分污染的可能性，符合GMP生产要求。mRNA药物的诸多优势和前景吸引了众多生物技术企业投身相关药物研发工作。
表1. 全球主要在研mRNA药物（临床中后期阶段） 来源：凯莱英整理
1.1 传染病预防（疫苗）
所谓mRNA疫苗，指通过不同的技术手段将编码抗原蛋白的mRNA递送到人体细胞内，表达翻译成所需的抗原蛋白，刺激机体产生特异的免疫反应。相较于传统疫苗而言，mRNA疫苗基于病毒的保守区域设计，直接在细胞中翻译产生特定抗原，从而激活机体免疫应答产生抗体。
面对严峻的新冠疫情，全球创新制药企业正全力开发针对新冠肺炎的药物及疫苗。其中，最值得关注的就是基于mRNA技术的新型疫苗。除了预防新冠病毒的mRNA疫苗之外，用于预防其他传染病的mRNA疫苗主要针对流感、呼吸道合胞病毒（RSV）和HIV等。
表2. mRNA疫苗中后期管线 （来源：广发证券）
表3. 全球mRNA疫苗研发代表性企业 （来源：广发证券）
表4. 各类疫苗生产路线对比 （来源：广发证券）
从商业化生产角度而言，虽然目标抗原不尽相同，但多数mRNA疫苗的制备纯化过程基本相似，凭借标准化的“套路”就能很快获得目标mRNA序列，因此能大幅节省时间成本及研发、生产费用。实际上，mRNA疫苗可凭借简单设备实现标准化量产，随用随制没有存储成本，相比传统疫苗6~8个月的生产周期，mRNA疫苗有望40天内完成样品的制备，3个月内即可完成GMP生产及QC，而且标准化生产对场地要求低，尤其是化学方法合成核酸仅要求普通GMP场地即可，安全性高、批次间差异小，具有响应快速、廉价量产的优势，在应对新冠等大规模流行性传染病中具有天然优势，这是传统疫苗难以比拟的。
1.2 肿瘤治疗
根据给药途径不同，治疗性mRNA肿瘤疫苗可分为两类，基于树突状细胞（DC）给药的mRNA疫苗和直接注射的mRNA疫苗。DC疫苗是通过体外转录后的mRNA转染至DC后，在细胞质中翻译形成抗原，与DC细胞作用激活DC细胞；将已激活的DC细胞注入人体，激发体内免疫系统应答，以达到杀死肿瘤细胞的目的。直接注射的mRNA疫苗可使用常见的递送途径（皮内，肌内，皮下或鼻内），也可以使用一些非常规的疫苗接种途径（结节内，静脉内，脾内或肿瘤内），将编码相关抗原的mRNA导入患者体内，从而刺激机体产生抗体，抑制肿瘤细胞生长。目前mRNA肿瘤疫苗研发企业主要有Moderna、BioNTech和CureVac等。
表5. 治疗肿瘤mRNA药物中后期管线
1.3 罕见病治疗
mRNA药物还可用于罕见病治疗，研发进展较快的是Translate Bio治疗囊性纤维化的MRT-5005，现已进入2期临床阶段。
表6. 治疗罕见病mRNA药物中后期管线
基于mRNA技术广阔的应用前景，全球已涌现出众多生物公司在该赛道上奋力冲关，如Moderna、CureVac、BioNTech、RaNA、Translate Bio、Ethris、Arcturus、Acuita等。尽管这些公司在mRNA药物研发方面已取得不小突破，但仍未完全解决mRNA药物制备过程中的递送、脱靶效应和免疫原性等关键问题，尚需要持续优化的生产工艺和关键技术作为有力支撑。
2.mRNA药物关键技术
业界普遍认为，mRNA药物领域需解决的三大核心问题是：避免免疫原性、提高稳定性和翻译效率、提升递送效率。
2.1避免免疫原性
由于外源RNA会被认为是病毒感染的信号，因此解决IVT mRNA的免疫原性至关重要。研究发现，降低mRNA中U的含量能解决免疫原性问题。迄今已有几种核苷酸化学修饰策略用于降低免疫原性的同时不影响mRNA的翻译，包括替换天然腺苷为N1-和 N6-甲基腺苷(m1A,m6A)，将天然胞苷替换为5-甲基胞苷（m5C），并将天然尿苷替换为（m5U）、s2U、5moU、假尿苷（ψ）或m1ψ。在上述修饰物中，m5C和ψ最受欢迎，它们能在显著降低mRNA免疫原性的同时提高体内外翻译效率。
另外，优化密码子增加mRNA中GC含量比例也能消除免疫原性。CureVac 公司与 Acuitas Therapeutics合作发明了一种新方法，重新设计了EPO蛋白的mRNA结构，在不用任何mRNA化学修饰的情况下，通过为每个氨基酸选择富含GC的密码子，再借助脂质纳米颗粒（LNP）递送到试验动物猪的体内，发现没有任何免疫原性被检测到，但也要注意高GC含量的密码子不利于蛋白的高表达。
体外转录后，还要经过一系列纯化过程包括浓缩、沉淀、萃取和色谱分离才能产生最终的mRNA。据报道，具有ψ修饰的mRNA经HPLC纯化后就不再有免疫原性，蛋白质翻译效率显著提高。在一个代表性案例中，Pardi等人合成的经m1ψ修饰和HPLC纯化的mRNA能编码HIV病毒抗体VRC01的轻链和重链，并将其包裹在LNP形成制剂，为实验小鼠全身性给药后，mRNA-LNPs能迅速转化为功能性抗体，一次注射就可以完全保护小鼠免受HIV-1病毒的感染。
2.2 提高稳定性和翻译效率
研究表明，在mRNA结构中5’帽在mRNA的成熟、剪接、翻译和无义介导的mRNA降解中发挥关键性作用。3’端的poly（A）尾巴对mRNA的稳定和后续翻译过程至关重要。3’端UTR区域包含α-和β-球蛋白基因的3’端UTR序列，也可以增强mRNA的稳定性和翻译效率，同时3’端和5’端UTR区域可以抑制mRNA的降解。
图2. mRNA结构修饰 来源：mRNA therapeutics deliver a hopeful message, Nano Today
为了稳定表达mRNA，科研人员设计了几种帽子结构对5’帽进行优化修饰。mRNA帽由7-甲基鸟苷组成（m7G），在转录过程中通过5’,5’-三磷酸桥（ppp）（m7GpppN结构体）与第一个转录的RNA核苷酸连接，不仅与翻译起始因子4E（EIF4E）结合参与RNA翻译，还与DCP1 / DCP2形成复合物结合调节RNA降解。近年来，一种含有单个硫代磷酸酯（O-to-S）的S类似物帽结构被开发出来，用S代替ARCA有两点好处，增加帽结构结合4E的亲和力，并降低对DCP1 / DCP2的易感性。
对于Poly A结构，业界倾向于使用DNA模板体外转录长度一定的Poly A尾巴。而更长的尾巴结构发现能增加各类细胞的蛋白表达，比如100个核苷酸的Poly A尾巴与5’ARCA 帽类似物能持续增加树突状细胞的蛋白表达。一般而言，120个长度的核苷酸尾巴比64个核苷酸长度的尾巴更能增加蛋白表达。
2.3 提升递送效率
为了在细胞中适量表达蛋白质，必须将合成的mRNA安全高效地递送到靶细胞细胞质中，这也是mRNA药物研发面临的一大挑战。有效的递送系统必须具有以下功能：1、结合mRNA形成复合物；2、促进细胞摄取；3、保护mRNA免受细胞内和细胞外核酸酶的侵蚀降解；4、将mRNA释放到细胞质中。
随着纳米技术的飞速发展，一大批纳米载药技术应运而生，包括脂质体、纳米粒、微乳、药质体等，其中经典的阳离子脂质有DOTMA、DOTAP、DOPE等，在DNA、siRNA和mRNA药物递送中广泛应用。在实际研发中，科研人员通过调节关键脂质成分和辅助脂质、PEG-脂质和胆固醇的摩尔配比，或添加鱼精蛋白，成功实现有效的mRNA传递和蛋白表达。
聚合物或其衍生物是mRNA运送载体的另一大分支，例如线性或支链聚乙烯亚胺（PEI）是一种广泛用于体外和体内核酸递送的阳离子聚合物，其他常用的聚合物还有TarN3C10，DD90-C12-122，PbAE-PCL（A1，C1），氨基聚酯和hDD90-118等。电荷改变型可释放转运蛋白（CARTs）也是新晋的载体。此外，传递mRNA的常用方法还包括电穿孔或电转染，施加高压电脉冲让细胞膜通透性增加，从而吸收周围介质中的mRNA，对某些细胞而言，电穿孔比脂质载体的递送效果更好。
表7. mRNA药物递送技术
来源：Formulation and Delivery Technologies for mRNA Vaccines, Current Topics in Microbiology and Immunology
3.凯莱英积极搭建mRNA药物技术平台
作为全球领先的医药行业CDMO一站式综合服务商，凯莱英始终以加速新药研发上市、提升生命质量为己任，依托持续的研发投入与技术创新，为全球大中型制药企业、生物技术公司提供高效和高质量的研发与生产服务，助力包括mRNA药物在内的创新品种的工艺开发与商业化生产。
凯莱英现已搭建技术先进的生物工程技术中心，建立专业、成熟的生物工艺开发团队，尤其在体外转录表达方面有着丰富经验。凯莱英从生物转化工艺的研发到放大生产均具备业界领先水平，可满足客户在生物工程技术的开发、应用、放大生产等方面的各类需求。公司现已形成5大技术平台：酶开发及筛选平台、酶生产平台、生物转化平台、固定化平台、生物合成平台。其中生物合成平台拟扩展多肽生物合成、无细胞合成和核酸生物合成等新技术服务。
基于深厚技术底蕴，依托先前开发的体外转录原件，凯莱英正不断提高mRNA体外转录试剂的自研发比例，降低生产成本。同时，积极探索mRNA合成的新技术路径，力争消除现有的体外转录工艺在产物5’ 端和3’ 端的不均一性，并开拓mRNA合成的新思路，力争构建比体外转录更加有效的mRNA合成路径。
伴随mRNA关键技术的进步，mRNA药物或将展现出巨大优势和应用前景，成为人类对抗疾病的强大武器。面对全球新冠疫情与研发热潮，凯莱英积极探索mRNA体外转录生物合成技术，简化mRNA合成与纯化工艺，通过技术攻关加速新药研发进程，满足临床需求，惠及全球患者，创造社会价值，守护人类健康！
参考资料
[1] 各公司官网.
[2] 中金公司-医疗健康行业mRNA疫苗：疫苗产业的新星.
[3] 中泰证券-生物制品行业：新冠病毒疫苗研究系列2，mRNA疫苗究竟是“何方神圣”？
[4] 广发证券-医药生物行业：疫苗行业专题之mRNA疫苗篇，通用的平台型技术，未来大有可为.
[5] 药渡-全球mRNA制药全景图.
[6] Sergio Linares-Fernandez, Celine Lacroix, Jean-Yves Exposito, Bernard Verrier. Tailoring mRNA Vaccine to Balance Innate/Adaptive Immune Response. Trends in Molecular Medicine. 2020, 26, 311.
[7] Cuiling Zhang, Giulietta Maruggi, Hu Shan, Junwei Li. Advances in mRNA Vaccines for Infectious Diseases. Frontiers in Immunology. 2019, 10, 594.
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[9] Yuhua Weng, Chunhui Li, Tongren Yang, etc. The challenge and prospect of mRNA therapeutics landscape. Biotechnology Advances. 2020, 40, 107534.
[10] Chunxi Zeng, Chengxiang Zhang, Patrick G. Walker, Yizhou Dong. Formulation and Delivery Technologies for mRNA Vaccines. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2020, Online ahead of print.
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[12] Ugur Sahin, Katalin Karikó, Özlem Türeci. mRNA-based therapeutics—developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 2014, 13, 759.
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